Caracterización de genes CBF (c-repeat binding factors) de Eucalyptus globulus y su validación como genes candidatos que regulan la resistencia al frío mediante transformación genética en Arabidopsis thaliana.

Abstract

Eucalyptus globulus es la principal especie latifoliada de maderas duras y de rápido crecimiento utilizada en la industria forestal chilena para la producción de pulpa de celulosa, por su alto rendimiento y excelente calidad de fibra. Sin embargo, esta especie presenta una alta sensibilidad a temperaturas de congelamiento, que afectan a su establecimiento, crecimiento y productividad. Hace tres décadas, varios investigadores han focalizado sus estudios en explicar los mecanismos que regulan la repuesta al frío y congelamiento en plantas, utilizando para ello el análisis de expresión génica y transformación genética. En este estudio se identificó nuevos genes que codifican a factores de transcripción C-repeat binding factor (CBF), como principales elementos de señalización en respuesta al estrés por frío en plantas. Se determinó su expresión génica enfocándose sobre el proceso de aclimatación al frío en tres diferentes genotipos de E. globulus, contrastantes en su supervivencia y daño frente a exposición a heladas. También, se validó la función putativa los genes mediante transformación genética en Arabidopsis thaliana. Adicionalmente, se evaluó la regulación de regiones promotoras de dos genes deshidirna 2 (DHN2) de dos especies, con diferencias en su resistencia al frío, E. globulus (Eugl) y E. nitens (Eni), generando como hipótesis que el promotor putativo EniDHN2 presenta una mayor inducción del gen bajo estrés por frío, como un rol importante en conferir resistencia al frío para la especie. El aislamiento de secuencias homologas a genes CBF permitió identificar y caracterizar tres nuevos genes en E. globulus. Estos fueron denominados EglCBF1a, EglCBF1c y EglCBF1d, los cuales codifican para tres diferentes proteínas de 220, 229 y 196 residuos de aminoácidos, respectivamente. Estos presentan un dominio AP2/ERF de unión a DNA, como también dos motivos con residuos de aminoácidos PKKP/RAGRxKFxETRHP y DSAWR que flaquean el dominio, siendo característicos de estos factores de transcripción. Los análisis de expresión de genes CBF determinan que el gen EglCBF1c se expresa constitutivamente en plantas no aclimatadas y en plantas aclimatadas expuestas a heladas nocturnas de –2 ºC, en respuesta al congelamiento. Por otra parte, los genes EglCBF1a y EglCBF1d se inducen en respuesta al estrés por frío y congelamiento. La mayor acumulación de transcritos ocurre en plantas aclimatadas expuestas a heladas nocturnas, disminuyendo notablemente en el tratamiento de desaclimatación. Además, uno de los genotipos categorizados como resistentes al estrés por frío, presentó mayores niveles de transcritos para los tres genes evaluados en plantas aclimatadas, en comparación con el genotipo sensible al congelamiento. Estos resultados respaldan que los factores de transcripción CBF tendrían un importante rol en la resistencia al congelamiento en E. globulus, lo cual ha sido reportado en varias especies de plantas, tanto herbáceas como leñosas. La transformación genética en Arabidopsis de los tres diferentes genes EglCBF1, induce la acumulación de transcritos de genes COR (COR6.6, COR15a y ERD10) de respuesta a frío, en plantas no aclimatadas. Además, induce la expresión de un gen de señalización por vía ABA-dependiente (RAB18). La expresión relativa del gen COR15a al disminuir las temperaturas de 23 ºC a 4 y –6 ºC, fueron mayormente inducidos en plantas transformadas que en plantas no transformadas. La sobreexpresión de los tres genes EglCBF1 en Arabidopsis no sólo mejoró la tolerancia al congelamiento en plantas transformadas, sino que también inhibe el crecimiento y retrasa la floración. Estos resultados evidencian la función putativa de los genes EglCBF1 como factores de transcripción, mejorando la resistencia al frío y congelamiento en plantas. Finalmente, los resultados de expresión del gen marcador (GUS) asociado a los promotores de los genes deshidrina 2 de E. globulus y E. nitens, determinaron que el promotor del gen EniDHN2, presento mayor acumulación de transcritos de GUS que el promotor del genes EuglDHN2, cuando se expone a temperaturas frías, sugiriendo que estas características diferenciales podrían otorgar mayor resistencia al frío por parte de la especie E. nitens.